HPLC 的正确使用和科学保养

特别提示:反复认真地阅读仪器使用说明书 , 做到对仪器的主要部件如进样阀、高压输液泵、检测器和数据处理机的功能、特点及其相互关联匹配情况 ,熟悉、理解 ,融会贯通。严格按照说明书要求 ,进行规范操作 ,这是正确使用和科学保养仪器的前提。

1、保持贮液瓶清洁 ,对专用贮液瓶应定期清洗;用试剂瓶作贮液瓶时 ,要经常更换。

2、定期(如半个月) 在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器 ,保持过滤器畅通无阻。

3、使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相,所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长,对不是HPLC 级的试剂要进行过滤(HPLC 级试剂出厂前已用 0. 02μm 滤膜过滤) 。对流动相一定要脱气。

4、每天开始使用仪器,注意放空排气 ,确保泵头、流动池以及其他流路系统中无气泡存在。

5、珍惜保护色谱柱 ,避免柱头突然产生大的波动 ,扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。

6、采用保护(警戒)柱 ,延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头 ,造成柱压升高 ,柱效下降 , 峰形变差时 ,卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。

7、避免超负荷进样,对 250 ×4. 6 mm的柱子 ,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下,应尽量将试样浓度降低 ,减少绝对进样量(进样体积可保持不变) ,这是保持HPLC 柱性能持久良好的重要举措之一。

8、经常用强溶剂冲洗柱子,将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇 - 二氯甲烷(1 : 1)冲洗 ,正相(硅胶柱)用纯甲醇或异丙醇冲洗 ,时间均不少于1 h。

9、做完试验,及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀,尤其是对过夜的柱子和进样阀 ,一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液,再用甲醇或乙腈冲洗 ,并保存在乙腈中。正相柱保存在非极性有机溶剂(如己烷)中。

10、以硅胶为基质的柱子,如 C - 18 ,C - 8 等 ,要控制好流动相的pH值 ,一般不要低于2. 5 , 不高于7. 0。

11、尽量用流动相溶解样品 ,一是避免出现拖尾峰、怪峰 ,二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。

12、对于阻塞或受伤严重的柱子,必要时,可卸下不锈钢滤板 ,超声洗去滤板阻塞物,对塌陷污 染的柱床进行清除、填充、修补工作 ,此举可使柱效恢复到一定程度(80 %) ,有继续使用的价值。

13、色谱仪检测器输出与积分仪(处理机) 要匹配 ,要合理设置参数如斜率、半峰宽、阈值、 AUFS值、衰减等。将适宜的进样量和合适的参数结合起来 ,使主峰峰高达到记录仪满量程的80 %左右。

14、用 HPLC 分析酸碱性物质,由于吸附作用(次级保留)使峰形拖尾。加入改良剂可以大大改善峰形 ,提高积分的准确度。

一般规则是: （1）分析酸性物质 ,可加入 1 %的醋酸。

           （2）分析碱性物质 ,可加入 10～20 mmol/ L 三乙胺。

           （3）酸碱物质混为一体 ,可同时加入1 %的醋酸和 10～20 mmol/ L 三乙胺。

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